恒溫金屬浴操作方法及常見(jiàn)問(wèn)題對(duì)策
發(fā)布時(shí)間：2014-01-13 閱讀：614次
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1.變性溫度與時(shí)間PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開(kāi)，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時(shí)間越長(zhǎng)變性就越充分。
但溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中個(gè)循環(huán)變性重要，需時(shí)間較長(zhǎng)，因模板DNA的鏈比較長(zhǎng)。
2．復(fù)性溫度與時(shí)間變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯(cuò)配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)增加非特異的復(fù)性。
