影響PCR反應(yīng)的因素
發(fā)布時(shí)間：2013-09-10 閱讀：892次
(一)模板
PCR反應(yīng)的模板可以是DNA,也可以是多NA，后者的擴(kuò)增需步反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能
作為模板進(jìn)行PCR循環(huán).模板的質(zhì)和量會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性和性。
不同來源的核酸標(biāo)本，如臨床標(biāo)本（血液、痰液、尿液、體腔積液）、法醫(yī)學(xué)標(biāo)本（血斑、毛發(fā)）病理標(biāo)本(如組織切片)以及考古標(biāo)本等.可以選用不同的方法直接提取DNA。無論標(biāo)本來源如何，待擴(kuò)增的核酸均需要純化擴(kuò)盡使核酸標(biāo)本中不含蛋白酶、核酸酶，特別是TaqDNA聚合酶抑制劑。
(二)引物
引物的選擇是整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。理想的引衡應(yīng)該有效地與靶序列雜交。引物的質(zhì)和量直接影杯PCR反應(yīng)的特異性和性，特別是特異性。
1.PCR反應(yīng)對(duì)引物的要求
合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酞胺凝膠電泳或反向高壓液相色譜(HP1.C)純化，以減少發(fā)生非特異擴(kuò)增的可能性。凍干引物可以在常溢下運(yùn)輸.凍干引物于一20℃可以保存12-24個(gè)月，甚至長(zhǎng)，液體狀態(tài)于-20℃可以保存6個(gè)月或長(zhǎng)
2.引物對(duì)PCR反應(yīng)的影響
兩條引物的用量一般為每條0.1~0.5mmol/L濃度太高會(huì)引起錯(cuò)配及非特異性擴(kuò)增,增加引物之間形成二聚體的概率;引物濃度太低則可能達(dá)不到擴(kuò)增效果或PCR產(chǎn)太低。
(三)循環(huán)溫度和時(shí)間
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的三個(gè)基本步驟即變性、退火和延伸在反應(yīng)體系的合適條件下進(jìn)行。變性溫度一般為90-96 .C，在此溫度下既能使DNA雙鏈模板變性，又能保持Taq DNA聚合酶活力。退火溫度必須嚴(yán)格按照形成模板一引物雜交體的實(shí)際需要選擇，可根據(jù)公式幾=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。退火溫度太高，會(huì)因?yàn)椴荒苄纬赡０逡灰镫s交體而不能有效擴(kuò)增目標(biāo)片段，退火溫度太低易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。退火溫度選擇的一般原則是應(yīng)低于幾值5℃。多數(shù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度在50-65℃。延伸溫度常用70-74℃。延伸時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段長(zhǎng)度確定。循環(huán)次數(shù)的確定，以既能達(dá)到擴(kuò)增目的又盡量減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增為原則。PCR儀的循環(huán)次數(shù)一般為2035次.循環(huán)次數(shù)過多將增加非特異產(chǎn)物。
(四)Taq DNA聚合酶濃度
Taq DNA聚合酶在反應(yīng)體系中的終濃度常為2~2.5u/100uL。酶量過少，合成pcr產(chǎn)物量低，酶址過高則非特異性產(chǎn)物隨之增加。
(五)鎂離子濃度
鎂離子濃度對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性.和產(chǎn)址有明顯影響，特別是對(duì)Taq DNA聚合酶催化的
PCR反應(yīng)的影響尤為明顯。過址的鎂離子會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，而鎂離子濃度過低，又會(huì)使Taq DNA聚合酶的催化活性降低.，一般鎂離子濃度為0.5-2.5 mmol/L。
(六)脫氧核昔三磷酸濃度
4種 dNTP（dATP、dCTP、dGTP\dTTP）在反應(yīng)中濃度應(yīng)相等，一般為200umo1/L。濃度過高會(huì)抑制Taq DNA聚合酶活性，且引起Taq DNA聚合酶催化的堿荃錯(cuò)配。
